Essai in vivo pour corréler la bioluminescence bactérienne avec la densité cellulaire

Résumé

Source : Brodl, E., et al. Mesure in situ et corrélation de la densité cellulaire et de l’émission de lumière de bactéries bioluminescentes. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo démontre la mesure et la corrélation de la bioluminescence avec la densité cellulaire chez les bactéries transformées. Une seule colonie bactérienne est utilisée pour initier une culture liquide. La culture est placée dans un puits à la concentration cellulaire souhaitée. Un antibiotique et un inducteur sont ajoutés pour exprimer le gène nécessaire à la bioluminescence bactérienne. Les lectures d’absorbance et de bioluminescence sont effectuées à intervalles réguliers à l’aide d’un lecteur de plaques.

Protocole

1. Conception, préparation et expression de l’opéron lux chez Escherichia coli

Remarque : Voir le tableau des matériaux pour obtenir des renseignements sur les trousses commerciales utilisées dans cette section.

1. Pour transférer l’opéron lux dans E. coli, choisissez un vecteur pET standard avec des sites de restriction appropriés et un gène de résistance aux antibiotiques d’intérêt (p. ex., pET28a ; NcoI, XhoI, kanamycine).
2. Concevez les fragments et les amorces qui se chevauchent pour l’assemblage de Gibson en fonction de la séquence d’ADN de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank : DQ988878.2).
3. Mettre en place une réaction en chaîne par polymérase (PCR) standard avec les amorces conçues et l’ADN génomique isolé (acide désoxyribonucléique) de Photobacterium mandapamensis 27561 comme modèle.
   REMARQUE : L’isolement de l’ADN génomique de la souche bactérienne respective améliore l’efficacité de la PCR.
4. Purifier le produit PCR par purification en colonne de centrifugation.
5. Effectuer une digestion de restriction du vecteur pET28a isolé avec NcoI et XhoI à 37 °C pendant 45 min.
6. Purifier le vecteur linéarisé et les fragments de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et purification ultérieure en colonne de spin.
7. Déterminez la concentration d’ADN de chaque fragment et du vecteur linéarisé, et calculez les quantités optimales pour l’assemblage selon le protocole.
   REMARQUE : L’efficacité de l’assemblage dépend de la taille et du nombre de fragments et doit être ajustée selon le protocole du fabricant.
8. Après avoir combiné tous les fragments et le tampon dans un tube PCR, incubez le mélange d’assemblage dans une machine PCR à 50 °C pendant 1 h.
9. Transformer le produit vectoriel assemblé conformément aux protocoles de transformation standard pour la transformation des plasmides bactériens d’E. coli en un système approprié pour la réplication des plasmides à haut rendement (p. ex., E. coli TOP10 ou XL-1).
10. Prélevez les colonies de la plaque de transformation et striez les nouvelles plaques pour l’isolement de l’ADN.
11. Isolez l’ADN plasmidique selon les protocoles standard.
12. Pour vérifier l’assemblage correct du plasmide, y compris tous les fragments, effectuez d’abord une PCR de colonie selon les protocoles standard en utilisant des amorces spécifiques à chaque fragment assemblé.
13. En plus de la PCR de la colonie et de l’électrophorèse sur gel d’agarose qui s’ensuit, préparez tous les vecteurs d’assemblage isolés pour le séquençage de l’ADN afin de vérifier l’assemblage correct et les séquences d’ADN correctes.
14. Transformez le plasmide vérifié conformément aux protocoles de transformation standard pour la transformation du plasmide bactérien E. coli en un système E. coli approprié pour la production de protéines à haut rendement (par exemple, E. coli BL21).
    REMARQUE : Poursuivez directement avec le protocole d’expression ci-dessous. Pour un stockage plus long, la préparation d’un stock de glycérol est recommandée.

2. Expression de souchesmodifiées d’E. coli

1. Préparez une culture de nuit (ONC) pour l’expression par inoculation d’un volume approprié de milieu Luria-Bertani (LB) (p. ex., 100 mL) avec le stock de glycérol préalablement préparé des cellules d’E. coli BL21 transformées avec le plasmide assemblé ou directement à partir d’une plaque de transformation. Ajouter 100 μL de kanamycine (50 mg/mL ; gène de résistance aux antibiotiques de pET28a) et incuber l’ONC à 37 °C et 120 tr/min dans un agitateur d’incubateur pendant la nuit.
2. Inoculer la culture d’expression principale (p. ex., 800 mL de milieu LB) avec 8 mL d’ONC et ajouter 800 μL de kanamycine (50 mg/mL).
3. Incuber la culture principale à 37 °C et 120 tr/min dans un agitateur d’incubateur jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne une DO₆₀₀ de 0,6 à 0,8 (environ 2,5 h).
4. Réduire la température d’incubation à 28 °C.
5. Induire l’expression des protéines en ajoutant du propyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,1 mM.
   REMARQUE : Des tests empiriques ont montré que la réduction de la température à 28 °C donnait l’intensité lumineuse la plus élevée.
6. Observez les cellules jusqu’à ce qu’elles commencent à briller (environ 1 h).
   NOTE : Selon le but de l’expression, les cellules sont cultivées jusqu’au lendemain et sont ensuite récoltées, ou les cellules peuvent être maintenues en mouvement tant qu’elles brillent (maximum 48 h). La récolte des cellules et la purification de toutes les protéines peuvent être effectuées selon des procédures standard.

3. Expression des souches bioluminescentes bactériennes

REMARQUE : Les souches bioluminescentes bactériennes nécessitent un milieu de croissance spécifique/un milieu d’eau de mer artificiel pour la croissance et la production de lumière.

1. Préparez un milieu d’eau de mer artificiel composé de deux composants de milieu préparés séparément.
   REMARQUE : Les quantités suivantes correspondent à 1 L de milieu liquide ou à 1 L de milieu gélosée.
   1. Pour le milieu artificiel d’eau de mer, peser les sels suivants : 28,13 g de NaCl (chlorure de sodium), 0,77 g de KCl (chlorure de potassium), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (chlorure de calcium dihydraté), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (chlorure de magnésium hexahydraté), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonate de sodium) et 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfate de magnésium heptahydraté).
   2. Ajouter 1 L d’eau distillée et dissoudre tous les composants.
   3. Pour le milieu LB, pesez les ingrédients suivants : 10 g d’extrait de levure, 10 g de peptone et pour les plaques de gélose, 20 g d’agar-gélose supplémentaire.
   4. Ajouter 250 ml d’eau du robinet et dissoudre les composants.
   5. Autoclave les deux milieux préparés séparément à 121 °C pendant 20 min.
   6. Pour les plaques de gélose, combinez 250 ml de milieu LB avec 750 ml de milieu d’eau de mer artificielle directement après l’autoclave et préparez les plaques.
   7. Pour un milieu liquide, combinez 250 ml de milieu LB avec 750 ml de milieu d’eau de mer artificielle, soit directement après l’autoclavage, soit une fois refroidi.
      REMARQUE : Le milieu d’eau de mer artificielle peut devenir trouble par la précipitation de sel.
2. Striez les souches bactériennes bioluminescentes sur des plaques de gélose artificielle à l’eau de mer et incuberez-les pendant la nuit à 24 - 30 °C.
   REMARQUE : Le stockage à long terme des souches bactériennes est normalement obtenu en congelant les stocks de glycérol de la culture bactérienne. Les souches doivent toujours être stries sur des plaques de gélose en premier pour assurer des conditions de départ uniformes pour toutes les souches, avant de les utiliser pour des cultures liquides, en raison d’une phase de latence de croissance après la décongélation.
3. Préparez un ONC en inoculant 100 mL de milieu d’eau de mer artificielle avec une seule colonie de la plaque. Incuber l’ONC à 24 - 30 °C et 120 tr/min dans un agitateur d’incubation pendant la nuit.
4. Inculquer 800 mL de milieu d’eau de mer artificielle avec 8 mL d’ONC.
5. Incuber les cellules bactériennes à 24 - 30 °C et 120 tr/min dans un agitateur incubateur.
   REMARQUE : Le profil d’intensité lumineuse des bactéries bioluminescentes varie fortement avec la température. Selon les mécanismes de régulation de la production de lumière de la souche bactérienne respective, l’émission de lumière peut commencer après environ 1 à 6 h.
6. Observez les cultures de cellules bactériennes jusqu’à ce qu’elles commencent à briller (environ 1 à 6 h).
   REMARQUE : Selon le but de l’expression, les cellules sont cultivées jusqu’au lendemain et sont ensuite récoltées, ou les cellules peuvent être maintenues en mouvement tant qu’elles brillent. La récolte des cellules et la purification de toutes les protéines peuvent être effectuées selon des procédures standard.

4. Essai d’activité in vivo pour les souches bioluminescentes bactériennes et les souches d’E. coli modifiées

REMARQUE : Le stockage à long terme des souches est normalement obtenu par la congélation des stocks de glycérol de la culture bactérienne. Les souches doivent toujours être stries sur des plaques de gélose en premier pour assurer des conditions de départ uniformes pour toutes les souches, avant de les utiliser pour des cultures liquides, en raison d’une phase de latence de croissance après la décongélation.

1. Étalez la souche bactérienne bioluminescente souhaitée ou la souche modifiée d’E. coli sur une plaque de gélose et incubez à 28 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : La température d’incubation peut varier d’une souche à l’autre et doit être évaluée empiriquement. Pour pouvoir comparer des souches bactériennes bioluminescentes et des souches d’E. coli modifiées, les conditions de croissance doivent être identiques.
2. Inoculer 3 mL de milieu avec la souche respective avec une seule colonie à partir d’une plaque de gélose et incuber les cellules à 28 °C et 180 tr/min dans un agitateur d’incubation pendant environ 1 à 2 h.
3. Mesurer la densité cellulaire d’une dilution 1:10 de la culture liquide à 650 nm. Calculer le rapport et le volume d’une culture de 1 mL avec une DO 650 de 0,05.
   REMARQUE : L’essai subséquent sur lecteur de plaque déterminera la densité cellulaire à 650 nm afin d’éviter les interférences causées par l’émission de lumière des souches.
4. Pipetez le volume calculé de culture et de milieu dans une plaque à paroi noire de 24 puits avec un fond en verre. Pour la souche d’E. coli modifiée, ajouter 1 μL de kanamycine (résistance aux antibiotiques du vecteur pET28a) et 1 μL d’IPTG (induction de l’expression génique) aux échantillons. Placez un couvercle sur la plaque pour éviter l’évaporation pendant les mesures.
   REMARQUE : Pour s’assurer que le vecteur pET28a contenant l’opéron lux entier ne se perd pas lors de la culture d’E. coli, il faut ajouter de la kanamycine à chaque échantillon d’E. coli dans les puits de la plaque et pour s’assurer que la production de lumière des cellules E. coli peut être mesurée, l’expression génique doit être induite par l’IPTG. Pour éviter la diaphonie et les interférences de mesure, les plaques à puits à parois noires avec fond en verre et couvercles transparents ont montré les meilleurs résultats. Néanmoins, la diaphonie peut être observée, et les positions des puits doivent être choisies avec soin.
5. Démarrer la mesure dans un lecteur de plaques.
   REMARQUE : Le protocole du lecteur de plaques est basé sur un script spécialement développé pour ce test qui combine deux mesures, l’absorbance et la bioluminescence. Les points de données sont collectés toutes les 10 min avec une agitation permanente entre les mesures et une température constante de 28 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs Inc.	E2621S	pour 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymérase	Thermo Scientific	F530S
Q5 ADN polymérase haute fidélité	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Kit de purification de l’ADN génomique	Thermo Scientific	K0721	pour enzymes
de restriction et tampon 50 rxn (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV Kit de nettoyage en gel et PCR	Promega	A9282	pour 250 rxn
Monarch Kit d’extraction de gel d’ADN	New England Biolabs Inc.	#T1020S	pour 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	pour 250 rxn
GoTaq G2 DNA polymérase	Promega	M7841
24 puits noir sensoplate avec fond en verre	Greiner Bio One 662892
FLUOStar Omega lecteur de plaques	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analyse Logiciel	BMG Labtech		Version 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG